Mission 15 : La Bonne Enzyme

Contexte :

La mission était de déterminer la masse moléculaire d'une protéine utilisée pour une réaction de biocatalyse qui n’a pas  n'a pas donné les résultats attendus (faible rendement, formation de sous-produits...). Une des hypothèses pour expliquer cet échec était  que l'enzyme utilisée n'était pas la bonne protéine et/ou qu'elle n'était pas de qualité suffisante.

Objectif :

Vérifier l'enzyme utilisée pour une réaction de biocatalyse.

Stratégie d'analyse :

La détermination de la masse moléculaire d'une protéine nécessite une méthode d'analyse capable de mesurer des molécules de grande taille. La spectrométrie de masse est une technique de choix pour cette application.

Il existe 3 combinaisons possibles de solutions pour cette mission :

 

Solution 1       I5         S6        A1 ou A2         B1                        D6

Solution 2       I3         S3        A3                   B1                        D10

Solution 3       I5         S6        A3 ou A4         B1                        D10 ou(/et) D6

 

Choix du mode d'introduction :

L'échantillon purifié est introduit directement dans le spectromètre de masse. Cette approche est appropriée car la protéine α-amylase a déjà été purifiée, éliminant ainsi le besoin d'une étape de séparation supplémentaire. L'infusion (carte I5) ou le dépôt sur plaque (carte I3) peuvent être utilisés pour introduire l'échantillon directement dans le spectromètre de masse. Le choix de l’une ou l’autre carte dépend de la source d’ionisation qui est utilisée.

Choix de la source d'ionisation :

●      Solution 1 & 3 : L'électrospray (ESI) (carte S6) est une technique d'ionisation douce qui permet de transférer des ions de la solution à la phase gazeuse avec une fragmentation minimale. L'ESI est particulièrement adaptée aux protéines, car elle produit des ions multiplement chargés, ce qui permet de déterminer leur masse moléculaire.

●      Solution 2 : La désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI) (carte S3) est une autre technique d'ionisation douce couramment utilisée pour les protéines. Dans cette technique, l'échantillon est mélangé à une matrice qui absorbe l'énergie d'un laser, ce qui provoque la désorption et l'ionisation de l'analyte. En MALDI, l'ionisation des protéines produit principalement des ions simplement chargés (z=1), bien que la formation d'ions doublement chargés (z=2) puisse également être observée dans certains cas, mais dans une moindre mesure. La distribution de charge en MALDI est donc généralement plus simple qu'en électrospray (ESI), où les protéines peuvent porter de nombreuses charges.

Choix de l'analyseur :

Le choix de l'analyseur dépend de la technique d'ionisation utilisée et de la précision de masse requise.

●      Solution 1 : Un analyseur quadripolaire (carte A1) ou une trappe d'ions (carte A2) sont des analyseurs de basses résolutions relativement peu coûteux.

●      Solution 2 : Un analyseur à temps de vol (TOF) (carte A3) ou un Orbitrap (carte A4) sont des analyseurs de hautes résolutions qui permettent une excellente séparation des massifs isotopiques

●      Solution 3 : Un analyseur à temps de vol (TOF) (carte A3) offre une résolution et une précision de masse plus élevées.

Choix du mode de balayage :

Le mode Full Scan (carte B1) est utilisé pour enregistrer l'ensemble des ions produits dans la source d'ionisation. Ceci est essentiel pour déterminer la distribution de charges des ions protéiques et calculer leur masse moléculaire.

Choix du traitement des données :

●      Solution 1 : Les spectres de masse obtenus en ESI montrent une distribution de pics correspondant aux différents états de charge de la protéine. Pour déterminer la masse moléculaire avec les analyseurs basse résolution et la source électrospray, il est nécessaire d'utiliser un algorithme de déconvolution (carte D6) qui permet de convertir le spectre multi-chargé en un spectre simplifié ne contenant que la masse moléculaire de la protéine.

●      Solution 2: Pour les spectres obtenus en MALDI, on utilisera la carte D10 (Analyse du massif isotopique) pour vérifier l’état de charge de l’ion observé. En effet, pour rappel en spectrométrie de masse haute résolution, l'état de charge d'un ion peut être déterminé en analysant la séparation des pics isotopiques. L'inverse de l'espacement entre deux pics isotopiques consécutifs donne l'état de charge de l'ion z. Ainsi pour un signal à un m/z égal à X. on peut connaître à partir du massif isotopique la charge et recalculer M. En effet, nous avons X = m/z = [M+zH]+/z. Donc en multipliant X par z et en retranchant la masse exacte d’un proton multiplé par la charge déterminer la masse moléculaire.

●      Solution 3 : pour la solution 3 ionisation électrospray, nous pouvons utiliser la carte D6 pour déconvoluer les signaux multiples du fait de l’ionisation électrospray comme la solution n°1. Nous pouvons également déterminer pour un groupe de signaux déterminer l’état de charge puis la même moléculaire à partir de la résolution du massif isotopique comme la solution n°3.

 

Conclusion :

La détermination de la masse moléculaire d'une protéine par spectrométrie de masse nécessite l'utilisation d'une technique d'ionisation douce comme l'ESI ou le MALDI, couplée à un analyseur capable de mesurer avec précision le rapport masse/charge des ions protéiques. Avec un analyseur basse résolution, on réalisera une étape de déconvolution alors qu’avec des analyseurs hautes résolution, on étudiera le profil isotopique.

Choix des cartes :

●      Solution 1 : Carte I5 (Infusion), Carte S6 (Electrospray), Carte A1 (Quadripôle) ou A2 (Trappes d'ions), Carte B1 (Full Scan), Carte D6 (Déconvolution multichargés)

●      Solution 2 : Carte I3 (Dépôt sur une plaque), Carte S3 (MALDI), Carte A3 (Temps de vol), Carte B1 (Full Scan), Carte D10 (Analyse du massif isotopique)

●      Solution 3 : Carte I5 (Infusion), Carte S6 (Electrospray), Carte A3 (Temps de vol) ou A4 (Orbitrap), Carte B1 (Full Scan), Carte D6 (Déconvolution multichargés) ou D10 (Analyse du massif isotopique)