Mission 10b : Les métabolites miracles

 

Contexte :

Vous travaillez dans un laboratoire pharmaceutique sur de nouveaux médicaments. Des effets prometteurs sont suspectés d'être dus à des métabolites glucuroconjugués inattendus. Il fallait analyser un échantillon d'urine de patient pour trouver ces métabolites et déterminer leur masse moléculaire. Un spectre MS/MS d'un glucuroconjugué connu était disponible pour aider à identifier un schéma de fragmentation caractéristique.

 

Objectif :

L'objectif était d'identifier des métabolites spécifiques d'un médicament suspectés d'être des glucuroconjugués dans un échantillon d'urine, et plus précisément de déterminer rapidement leurs masses moléculaires.

Stratégie d'analyse :

La mission consistait à rechercher dans un échantillon urinaire des composés appartenant à une classe chimique spécifique (des métabolites glucuroconjugués) sans connaître a priori leur masse exacte. La stratégie clé reposait donc sur l'identification d'un schéma de fragmentation caractéristique et spécifique aux molécules possédant une glucuroconjugaison.

 

Choix du mode d'introduction :

L'analyse portait sur des métabolites présents dans une urine. Une introduction directe de l'échantillon non purifié ou partiellement purifié dans le spectromètre de masse, par Infusion (carte I5) ou Injection Directe FIA (carte I6) devait être évitée pour deux raisons majeures :

La première est liée aux effets matrices importants: L'introduction directe de l'urine sans aucune séparation chromatographique peut provoquer une forte suppression d’ions due à la présence de très nombreux composés de l’urine. Ces composés rentrent en compétitions avec  les métabolites d'intérêt lors de l'ionisation, masquant ou réduisant fortement le signal de ces derniers. Ainsi, un métabolite faiblement concentré pourrait ne pas être observé.

La seconde raison, concerne, un risque de Fragmentation en Source puis d'Interférences sur les signaux observés.

Attention, cette fragmentation n’est pas liée au mode d’introduction. Cette fragmentation non désirée dans l'interface source-analyseur peut survenir également en LC-MS/MS. Ce sont ses conséquences qui peuvent être préjudiciable.  Les  glucuroconjugués étant fragiles, cette fragmentation en source peut diminuer le signal de l'ion moléculaire du métabolite glucoro-conjugué et ainsi la sensibilité.  De plus, et c'est un risque majeur, si le glucuronide se fragmente en source en perdant sa partie sucre, il peut générer l'ion correspondant à la molécule mère (l'aglycone). Si cet ion est identique à celui du principe actif non métabolisé, sa détection interférera directement avec la quantification ou même la détection du principe actif lui-même, conduisant à des résultats erronés. Par exemple un principe actif de masse M s’est métabolisé en donnant un métabolite de masse M1 correspond à la masse M plus la masse de l’acide glucuronique ayant réagi. Après fragmentation du métabolite M1 en source, nous perdons la masse de l’acide glucuronique. Ce métabolite est donc observé un rapport m/z qui correspond à la masse M du principe actif. Si nous avons dans notre échantillon le métabolite et le principe actif, les signaux vont se superposer (s’additionner) si nous ne séparons avec la chromatographie ces 2 molécules.

L'utilisation d'une technique séparative en amont était donc indispensable pour séparer non seulement les métabolites des autres composés endogènes pour diminuer les effets matrices, mais également du principe actif pour éviter les interférences.

Parmi les techniques séparatives : La GC (carte I1) n'est pas adaptée aux glucuroconjugués qui sont polaires, thermolabiles et peu volatils. L'Électrophorèse Capillaire (CE) est moins courante et robuste pour ce type d'analyse de routine dans des matrices complexes par rapport à la chromatographie liquide.

Le choix s'était donc logiquement porté sur la LC (Carte I2) qui sépare efficacement les métabolites polaires de la matrice.

 

Choix de la source d'ionisation :

Une fois les composés séparés par chromatographie liquide, il faut les ioniser pour pouvoir les séparer par l’analyseur de masse. Plusieurs sources d'ionisation étaient disponibles, mais toutes ne sont pas compatibles avec la chromatographie en phase liquide ou adaptées aux analytes recherchés.

Quelles sont les sources incompatibles avec la chromatographie liquide ?  Les sources spécifiques à la chromatographie en phase gazeuse  (ionisation électronique -carte  S1 ou l’ionisation chimique – Carte S2) ne pouvaient pas être utilisées. La source MALDI (implicitement liée au mode d’introduction Dépôt sur plaque )- n'est pas couplée directement à la LC classique. Les sources DESI et ASAP sont des techniques d'ionisation ambiante non couplées à la LC dans ce contexte. Vous n’avez peut être pas vu, les mécanismes d’ionisation de ces sources en cours mais ce n’est pas grave. Vous ne les avez probablement pas proposées.

Les principales sources compatibles pour le couplage chromatographie liquide spectrométrie de masse sont l'Electrospray (carte  S6), l'APCI (carte S4) et l'APPI (carte S5).

L'APPI (carte S5) est généralement réservée aux composés très peu ou pas polaires, ce qui n'était pas le cas attendu pour des métabolites glucuroconjugués.

 

L'APCI (carte S4), bien que compatible avec LC, ionise en phase gazeuse après nébulisation/vaporisation. Elle est souvent plus performante pour les molécules de polarité modérée à faible. Elle nécessite surtout un fort chauffage pour volatiliser les molécules, au risque de dégrader les métabolites.

 

En revanche, l'ionisation électrospray (carte- S6) est efficace pour les molécules polaires, chargées ou facilement ionisables en solution. Ce qui est le cas ici de médicaments et leurs métabolites polaires. En effet, les conjugués glucuronides  possèdent des groupements -OH et -COOH polaires et un caractère acide). La carte S7 aurait pu être un choix intéressant mais impossible à sélectionner par rapport aux crédits disponibles

Choix du mode de balayage

Pour cette mission, nous allons d’abord expliquer le choix du mode de balayage. En effet, c’est ce choix qui va ensuite impacter le choix de l’analyseur.

L'objectif était d'identifier des métabolites glucuroconjugués présents dans une urine. La stratégie s'appuie sur la connaissance qu'une fragmentation caractéristique de ces composés. Comme, vous pouviez l’observer sur le spectre de  la mission, les molécules glucuroconjugués fragmentent en perdant un neutre caractéristique de masse 176 Daltons. Ce fragment neutre correspond à la partie acide glucuronique (C6H8O6). Un mode de balayage capable de détecter spécifiquement cette perte était donc recherché.

Le Mode de balayage "Perte de Neutre" (ou Neutral Loss Scan en anglais- Carte B6) était le mode de balayage idéal pour cette mission.

 

Pour rappel, son principe est le suivant :

Le premier analyseur :  un quadripôle Q1 d'un système MS/MS balaie une gamme de masses laissant passer un à un les ions présents. Tous les ions transmis par le quadripôle Q1 vers la  cellule de collision (Q2) sont ainsi fragmentés successivement.

Un second analyseur également un quadripôle (Q3), placé après la cellule de fragmentation Q2 balaie également une gamme de masses, mais de manière synchronisée avec le Q1, en maintenant un décalage de masse constant.  Ce décalage est réglé sur la masse du fragment neutre recherché (Dans notre cas 176 Da).

Ainsi, si à un instant t, Q1 laisse passer un ion de masse M1,  Le Q3 est réglé pour ne laisser passer que les ions de masse M2 égale à M1 moins la masse du neutre.  Par exemple, si on décide de faire un balayage de m/z = 300 à m/z= 500 sur le Q1. Le Q3 réalisera lui un balayage de m/z 124 (300-176) à m/z = 324 (500-176=324). Si on prend l’exemple de la mission, lorsque le Q1 arrivera à la masse 445 lors de son balayage, il va laisser l’ion moléculaire de la molécule passer. Cette molécule va ensuite se fragmenter dans la cellule de collision. Le second analyseur va balayer avec un écart de 176. Il laissera passer uniquement les ions de masse 269 (445-176) lorsque le Q1 laissera passer l’ion à  445. Ainsi, comme notre molécule en se fragmentant va donner deux ions majoritaires  à m/z = 175 et 269. L’ion à m/z = 269 se transmis vers le détecteur et un signal détecté indiquant qu’une molécule a perdu un neutre de masse 176 au moment où le quadripôle 1 balayé l’ion à 445.

Quelle information obtenons nous en final à un instant ? Nous obtenons comme information, un spectre de masse qui va représenter uniquement les  molécules présentes dans l’échantillon et qui ont perdu le neutre caractéristique. Le mode de balayage perte de neutre filtre ainsi l’information. Un spectre en mode balayage complet ou « Full scan » sur le Q1 aurait indiqué toutes les molécules présentes.

Pour information, il existe un mode de balayage dit « pseudo perte de neutres » que l’on retrouve sur certains Q-TOF ou  Q-orbitrap. Cependant, dans ce cas, les pertes neutres sont calculées mathématiquement plutôt que détectées et résolues physiquement. Le nombre de crédit à disposition ne vous permettez pas de choisir cette possibilité.

 

Comme expliquer, précédemment, Le Full Scan (carte B1) aurait détecté tous les ions, rendant difficile l'identification spécifique des glucuronides sans informations préalables sur leurs masses exactes. Le mode de balayage « Scan d'ions Produits » (Carte B4) ou le Scan d'ions Précurseurs (Carte B3) nécessitent de connaître soit le précurseur, soit un fragment spécifique, ce qui n'était pas le cas ici où l'on cherchait à découvrir de nouveaux métabolites .Le mode MRM (Carte B7) est un mode de balayage ciblé utilisé généralement pour  la quantification de composés déjà connus et optimisés, pas pour de la découverte.

Le choix s'était donc porté sur le mode de balayage Perte de Neutre (Carte B6)

 

Choix de l’analyseur:

Après avoir établi que le mode de balayage "Perte de Neutre" (Carte B6) était indispensable pour répondre à l'objectif de la mission, le choix de l'analyseur devenait évident. Ce mode de balayage spécifique est une technique de spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) qui impose l'utilisation d'un instrument capable d'effectuer une sélection d'ions précurseurs, leur fragmentation, puis une analyse des ions produits de manière synchronisée.

Le Triple Quadripôle (Carte A6) était la configuration d’analyseur à choisir. Seules les triples Quadripôle (Carte A6) ou certains Q-ions trap à éjection axiale (Carte A8) peuvent faire de la vraie perte de neutres à savoir une séparation physique.

 

Choix des paramètres expérimentaux

 

Pour que l'analyse en mode Perte de Neutre soit efficace et permette de détecter les métabolites glucuroconjugués recherchés, certains paramètres expérimentaux devaient être judicieusement choisis :

 

-        Polarité d'ionisation (Carte P3 : Ionisation positive et/ou négative) :

Les métabolites glucuroconjugués peuvent s'ioniser en mode positif (par exemple, en formant un ion [M+H] +  ou [M+Na]+, ou d’autres adduits), si la molécule correspondante au principe actif du médicament possède des sites basiques) ou en mode négatif (par exemple, en formant un ion [M-H]  grâce à la déprotonation de la fonction acide carboxylique de la partie glucuronide ou d'autres fonctions acides sur la molécule.

Comme la structure exacte des nouveaux métabolites était inconnue, et donc leur mode d'ionisation préférentiel également, il était stratégique de pouvoir explorer les deux polarités. La carte P3 ("Ionisation positive et/ou négative") évite de réaliser deux analyses distinctes (deux injections) une en positif, une en négatif ; elle permet plutôt d’utiliser une fonction de commutation de polarité de l'instrument, afin de maximiser les chances de détecter tous les métabolites glucuroconjugués potentiels, quelle que soit leur meilleure voie d'ionisation.

 

Tension d'interface (Carte P6 : Tension d'interface par défaut) :

La tension d'interface influence le transfert des ions de la source vers l'analyseur et peut aussi causer une fragmentation non désirée dite "en source" si elle est trop élevée.

Pour cette mission de "screening" où l'on cherchait à identifier des composés inconnus présentant une perte neutre spécifique, l'utilisation d'une tension d'interface par défaut (carte P6) était un choix pragmatique. L'objectif n'était pas une quantification ultra-optimisée d'un composé connu (qui nécessiterait une tension optimisée carte P4), mais plutôt d'assurer un bon transfert ionique général sans induire une fragmentation excessive en source. Une fragmentation en source trop importante aurait pu cliver la liaison glucuronide avant même que l'ion précurseur n'atteigne Q1, empêchant ainsi la détection de la perte neutre ciblée dans la cellule de collision Q2. La valeur par défaut visait donc à préserver l'intégrité des ions précurseurs.

 

Énergie de fragmentation (Carte P8 : Énergie de fragmentation moyenne ou gradient) :

Le mode Perte de Neutre repose sur la fragmentation des ions précurseurs dans la cellule de collision (Q2). L'énergie de cette fragmentation (énergie de collision) est un paramètre important pour observer la perte neutre spécifique de 176 Da.

Cependant, l'énergie de collision optimale pour induire cette perte peut varier d'un glucuroconjugué à l'autre en fonction de la stabilité de la liaison et de la structure de l'aglycone (la partie correspond à la molécule non-conjuguée ou d’origine) . Comme on recherchait des métabolites inconnus, il n'était pas possible d'optimiser cette énergie pour chaque composé. L'utilisation d'une énergie de fragmentation moyenne ou d'un gradient d'énergies de fragmentation (carte P8) était donc la meilleure approche. Une énergie moyenne offre un compromis susceptible de fragmenter un large éventail de glucuronides. Un gradient d'énergies (où l'énergie de collision est variée pendant l'acquisition ou pour différents cycles de balayage) augmente encore davantage la probabilité d'induire la perte de 176 Da pour n'importe quel métabolite glucuroconjugué qui serait élué de la colonne LC.

 

Ces choix de paramètres visaient donc à permettre une détection la plus large et la plus fiable possible des candidats glucuroconjugués, en accord avec l'objectif de la mission.

 

Traitement des données :

En couplage LC-MS ou LC-MS/MS, l’information que nous obtenons est un courant ionique total. Dans cette mission, nous obtenons des pics chromatographiques qui correspondent à toutes les molécules qui auront donné un fragment caractéristique. Les autres molécules ne seront pas détectée. Afin d’obtenir les masses moléculaires des corticoïdes, il faut passer du courant ionique total (TIC)  au spectre de masse en utilisant la carte D5 .Il faut cliquer sur le ou les pics chromatographiques d’intérêts et ainsi afficher les spectres de masses correspondants.

 

L'objectif final de la mission est de déterminer la masse moléculaire des métabolites glucuroconjugués qui ont été détectés grâce au balayage en Perte de Neutre. En couplage LC-MS ou LC-MS/MS, l’information que nous obtenons est un courant ionique total qui correspond à la somme de tous les ions à un instant t.

Dans cette mission, nous obtenons des pics chromatographiques qui correspondent à toutes les molécules qui auront perdu un neutre. Les autres molécules ne seront pas détectée. Afin d’obtenir les masses moléculaires des métabolites, il faut passer du courant ionique total (TIC)  au spectre de masse en utilisant la carte D5 .Il faut cliquer sur le ou les pics chromatographiques d’intérêts et ainsi afficher les spectres de masses correspondants.

C'est sur ce spectre de masse extrait que l'on peut déterminer le m/z de l'ion précurseur qui a effectivement perdu 176 Da.

Il n'y avait pas d'autres cartes de traitement de données nécessaires, car l'objectif s'arrêtait à la détermination de la masse moléculaire des métabolites.

 

Choix des cartes qui devaient être faits :

·       Mode d'introduction : I2 (LC)

·       Source d'ionisation : S6 (Electrospray)

·       Analyseur : A6 (Triple Quadripôle)

·       Mode de balayage : B6 (Perte de Neutre)

·       Paramètres expérimentaux : P3 et P6 et P8 (Ionisation positive et/ou négative ET Tension d'interface par défaut ET Énergie de fragmentation moyenne ou gradient)

·       Traitement de données : D5 (Du TIC au spectre MS)

 

Conclusion

 

Pour identifier rapidement les masses moléculaires de métabolites glucuroconjugués inconnus dans un échantillon complexe d'urine, l'approche analytique qui devait être mise en œuvre reposait sur la Chromatographie Liquide (LC) pour la séparation initiale, couplée à la Spectrométrie de Masse en Tandem (MS/MS).

L'ionisation par Electrospray (ESI) était la plus adaptée pour ces composés polaires. L'utilisation d'un Triple Quadripôle comme analyseur était indispensable pour effectuer le mode de balayage spécifique en Perte de Neutre, ciblant la perte caractéristique de 176 Da des glucuronides. Des paramètres expérimentaux généralistes, comme l'exploration des deux polarités d'ionisation, une tension d'interface par défaut pour préserver les précurseurs, et une énergie de fragmentation moyenne ou en gradient pour couvrir divers métabolites, ont permis une détection efficace. Enfin, l'extraction du spectre de masse MS1 à partir des pics détectés dans le balayage en Perte de Neutre a permis de déterminer la masse des ions précurseurs et donc la masse moléculaire des métabolites, répondant ainsi à l'objectif de la mission.

 

Cette stratégie a permis de "filtrer" la complexité de l'échantillon pour ne révéler que les composés présentant le schéma de fragmentation d'intérêt.