Mission 9 : Identification de Métabolites Potentiels

 Contexte :

Vous étudiiez le métabolisme du diazépam sur un modèle biologique. Une analyse LC/MS préliminaire avait révélé la présence d'un seul pic chromatographique. Deux structures et donc deux formules brutes étaient envisagées pour ce pic. La mission consistait à utiliser la spectrométrie de masse pour déterminer une ou plusieurs masses exactes et des formules brutes associées à un pic chromatographique. Ainsi, il est possible de valider les hypothèses structurales. Pour cela, nous devons être en mesure de bien séparer en MS les signaux de ces deux métabolites.

Objectif :

L'objectif était déterminer la formule brute d'un métabolite du diazépam détecté par LC/MS afin de confirmer sa structure parmi deux hypothèses possibles.

Stratégie d'analyse :

Le défi était de distinguer deux structures moléculaires potentielles ayant des masses proches. La stratégie reposait sur la mesure de la masse exacte de l'ion correspondant au métabolite grâce à la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS). Cette mesure précise permettait de déterminer la formule brute de l'ion et de la comparer aux deux formules hypothétiques. L'analyse préliminaire ayant été faite par LC/MS, il était logique de conserver le couplage LC-MS.

Choix du mode d'introduction :

 

La Chromatographie Liquide (LC) (Carte I2) était le mode d'introduction approprié. Elle avait permis lors de l'analyse préliminaire de séparer le métabolite du diazépam parent et potentiellement d'autres composants de la matrice biologique. Conserver la LC était essentiel pour analyser spécifiquement le métabolite élué à un temps de rétention donné.

 

Choix de la source d'ionisation :

Les sources APCI (Carte S4) et Electrospray (ESI) (Carte S6) étaient des options valides pour le couplage LC-MS :

·       ESI (carte S6) : Souvent privilégiée pour l'analyse de médicaments et de leurs métabolites, qui sont fréquemment polaires et s'ionisent bien en

·       APCI (carte S4) : Pouvait être une alternative, notamment si le métabolite était moins polaire ou plus volatil que la molécule mère. Le choix entre la carte S4 et la carte S6 pouvait dépendre des propriétés spécifiques du métabolite, mais les deux étaient compatibles avec la stratégie globale.

·       La carte S7 aurait pu être un choix intéressant mais impossible à sélectionner par rapport aux crédits disponibles

Choix de l’analyseur:

Pour déterminer une ou plusieurs formules brutes à partir de mesures de masses exactes, un analyseur à haute résolution était indispensable. Il y avait donc plusieurs choix d’analyseurs haute résolution. Pour faire le bon choix, il fallait tenir compte de la résolution nécessaire pour séparer par l’analyseur ces deux métabolites.IL fallait également tenir compte du nombre de crédit à disposition pour réaliser la mission. Le seul choix possible était l’orbitrap (carte A4). Les combinaisons d’analyseurs hautes résolutions comme les Q-TOF ou Q-orbitrap ou le FT-ICR n’ont pas été retenues du fait du nombre de crédits. Le temps de vols n’a pas été retenu du fait de sa résolution indiquée sur la carte qui était insuffisante.

 

 

·       D'après les données, les masses exactes pour le métabolite m1 = 286.087291 Da et pour le métabolite m2 = 286.050905 Da.

·       La différence de masse (Δm) entre ces deux ions était donc de ∣286.087291-286.050905∣ soit 0.036386 Da.

·       La résolution minimale requise (R) pour distinguer deux pics est R=m/Δm,

·       Ainsi, la résolution nécessaire était 286.087291 divisé par 0.036386 soit une résolution de 7862.

Puisque la résolution requise est supérieur (environ 7862) était significativement supérieure à la résolution maximale du TOF (5000), cet analyseur n'était pas capable de séparer les deux ions. La carte A3 n’était pas jouable.

Les analyseurs basse résolution (A1, A2) ou les analyseurs tandem utilisés en basse résolution pour la sélection (A6, A8) n'auraient pas fourni la résolution et la précision de masse requise pour déterminer la formule brute sans ambiguïté.

 

Choix du mode de balayage:

 

Le mode « Full Scan » (Carte B1) devait être utilisé. Pour mesurer la masse exacte de l'ion du métabolite élué de la colonne LC, il fallait acquérir le spectre de masse complet sur une gamme de m/z pertinente avec la haute résolution offerte par l'analyseur.

 

Traitement des données :

 

·       Du TIC au spectre MS (Carte D5) : Pour extraire le spectre de masse haute résolution au temps de rétention du pic chromatographique du métabolite.

·       Recherche de proposition de formules brutes (Carte D9) : Pour utiliser la masse exacte mesurée (depuis D5) afin de calculer les formules brutes possibles (avec une faible tolérance en ppm) et les comparer aux deux hypothèses pour identifier la bonne structure.

Conclusion :

L'identification de la structure correcte du métabolite a nécessité la détermination de sa formule brute par LC-HRMS. La combinaison LC (I2), source ESI (S6) ou APCI (S4), analyseur Orbitrap (A4), et un balayage mode Full Scan (B1) était requise. Le traitement des données via l'extraction du spectre (D5) et le calcul de formule brute (D9) a permis de finaliser l'identification.

 

Choix des cartes:

 

Mode d'introduction : I2 (LC)

Source d'ionisation : S4 ou S6 (APCI ou Electrospray)

Analyseur : A4 (Orbitrap)

Mode de balayage : B1 (Full Scan)

Traitement de données : D5 puis D9 (Du TIC au spectre MS puis Recherche de proposition de formules brutes)